Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Diari » Rivista Internazionale di Nanomedicina » Volume 16Effetto citotossico specifico di un nanoconiugato di auristatina verso cellule di linfoma diffuso a grandi cellule B CXCR4+Autori Falgàs A, Pallarès V, Unzueta U, Núñez Y, Sierra J, Gallardo A, Alba-Castellón L, Mangues MA , Álamo P, Villaverde A, Vázquez E, Mangues R , Casanova IPubblicato il 5 marzo 2021 Volume 2021:16 Pagine 1869—1888DOI https://doi.org/10.2147/IJN.S289733Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Dr Thomas J WebsterAïda Falgàs,1– 3 Victor Pallarès,1– 3 Ugutz Unzueta,1– 4 Yáiza Núñez,1,2 Jorge Sierra,2,5 Alberto Gallardo,1 Lorena Alba-Castellón,1,2 Maria Antonia Mangues,3,6 Patricia Álamo,1– 3 Antonio Villaverde,3,4,7 Esther Vázquez,3,4,7 Ramon Mangues,1– 3 Isotta Casanova1– 3 1Istituto di ricerca biomedica Sant Pau (IIB-Sant Pau), Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcellona, ​​08025, Spagna;2Josep Carreras Leukemia Research Institute (IJC), Barcellona, ​​08916, Spagna;3CIBER de Bioingeniería Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN), Madrid, 28029, Spagna;4Dipartimento di Genetica e Microbiologia, Universitat Autònoma de Barcelona, ​​Barcellona, ​​08193, Spagna;5Dipartimento di Ematologia, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcellona, ​​08025, Spagna;6Dipartimento di Farmacia, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Barcellona, ​​08025, Spagna;7Institute of Biotechnology and Biomedicine (IBB), Universitat Autònoma de Barcelona, ​​Barcelona, ​​08193, Spagna Corrispondenza: Esther Vázquez Institute of Biotechnology and Biomedicine (IBB) and Department of Genetics and Microbiology, Universitat Autònoma de Barcelona e CIBER-BBN, Barcelona, ​​Spagna Tel +34 935812148 E-mail [e-mail protetta] Ramon Mangues Istituto di ricerca biomedica Sant Pau (IIB-Sant Pau), Josep Carreras Leukemia Research Institute (IJC) e CIBER-BBN, Barcellona, ​​Spagna Tel +34 935537918 E-mail [e-mail protetta] Sfondo e Scopo: circa il 40-50% dei pazienti con linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) soffre di malattia refrattaria o recidiva dopo il trattamento di prima linea con R-CHOP.Molti studi clinici in corso per i pazienti con DLBCL coinvolgono agenti di targeting dei microtubuli (MTA), tuttavia, la loro attività antitumorale è limitata da gravi effetti collaterali.Pertanto, abbiamo scelto di migliorare la finestra terapeutica della monometil auristatina E MTA sviluppando un nanoconiugato, T22-AUR, che mira selettivamente al recettore CXCR4, che è sovraespresso in molte cellule DLBCL (CXCR4+) e associato a prognosi sfavorevole.Metodi: La specificità T22-AUR verso il recettore CXCR4 è stata eseguita mediante citometria a flusso in diverse linee cellulari DLBCL ed eseguendo saggi di biodistribuzione in un modello murino sottocutaneo contenente cellule DLBCL CXCR4+.Inoltre, abbiamo determinato la citotossicità T22-AUR utilizzando saggi di vitalità cellulare, analisi del ciclo cellulare, colorazione DAPI e immunoistochimica.Infine, l'effetto antineoplastico T22-AUR è stato valutato in vivo in un modello murino extranodale CXCR4+ DLBCL mentre l'analisi di tossicità è stata valutata mediante istopatologia in organi di topo non infiltrati e mediante saggi citotossici in vitro in PBMC umani.Risultati: Dimostriamo che il nanoconiugato T22-AUR mostra il targeting e l'interiorizzazione dipendenti da CXCR4 nelle cellule CXCR4 + DLBCL in vitro e in un modello murino DLBCL sottocutaneo.Inoltre, mostra un elevato effetto citotossico nelle cellule CXCR4+ DLBCL, inclusa l'induzione dell'arresto mitotico G2/M, il danno al DNA, la catastrofe mitotica e l'apoptosi.Inoltre, il nanoconiugato mostra una potente riduzione della disseminazione del linfoma nel topo senza alterazioni istopatologiche negli organi non infiltrati con DLBCL.È importante sottolineare che T22-AUR mostra anche mancanza di tossicità nei PBMC umani.Conclusione: T22-AUR esercita un effetto antitumorale in vitro e in vivo sulle cellule CXCR4+ DLBCL senza tossicità off-target.Pertanto, T22-AUR promette di diventare una terapia efficace per i pazienti con CXCR4+ DLBCL.Parole chiave: nanomedicina, somministrazione mirata di farmaci, MMAE, DLBCLIl linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) è il linfoma non Hodgkin (NHL) più frequente.1 Sebbene l'aggiunta di rituximab alla chemioterapia standard abbia migliorato l'esito dei pazienti con DLBCL, circa il 40-50% di essi sviluppa recidiva/refrattario (R/R) malattia dopo trattamento con rituximab più ciclofosfamide, doxorubicina, vincristina e prednisone (R-CHOP).2,3 Questa viene solitamente gestita con chemioterapia di salvataggio e, dopo una risposta completa o parziale, i pazienti vengono sottoposti a trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT).Tuttavia, i pazienti di età inferiore ai 60 anni con indice prognostico internazionale (IPI) elevato e DLBCL disseminato non hanno una terapia standard di prima linea.Inoltre, alcuni pazienti con DLBCL non rispondono alla chemioterapia ad alte dosi o non sono inizialmente candidati all'HSCT (terapia di seconda linea) o addirittura falliscono l'HSCT (che necessitano di una terapia di terza linea).4 Inoltre, l'attuale chemioterapia può indurre effetti collaterali pericolosi per la vita nei pazienti con DLBCL.5 Pertanto, sono urgentemente necessari nuovi trattamenti per potenziare il loro effetto antineoplastica nelle cellule di linfoma senza danneggiare le cellule normali.Nanoparticelle attivamente mirate, contenenti un ligando che consente il loro targeting specifico a un recettore sovraespresso nelle cellule tumorali, sono apparse come un'opzione promettente.6,7 Qui, abbiamo scelto il recettore CXCR4 per colpire le cellule di linfoma, poiché circa il 30-50% di DLBCL le biopsie sovraesprimono questo recettore (CXCR4+)8,9 e la sua espressione nelle cellule di linfoma è molto più alta rispetto alle cellule B normali.10 Inoltre, la sovraespressione di CXCR4 è un fattore prognostico scarso nei pazienti con DLBCL.9,11È interessante notare che gli agenti mirati ai microtubuli (MTA) promettono di diventare potenti carichi utili di farmaci nei trattamenti antitumorali.I microtubuli sono polimeri di tubulina e componenti essenziali del citoscheletro che subiscono un costante assemblaggio e disassemblaggio all'interno della cellula.Il ruolo principale dei microtubuli è la segregazione dei cromosomi ai poli del fuso durante la mitosi con la conseguente formazione di cellule figlie.12 Tuttavia, sono coinvolti in molti altri processi cellulari, come il traffico intracellulare, la migrazione e l'angiogenesi.13,14 Pertanto , le loro caratteristiche dinamiche e la loro implicazione nella sopravvivenza delle cellule tumorali li rendono buoni bersagli antineoplastici.Il nostro gruppo ha progettato un nanoconiugato terapeutico T22-AUR che include il nanocarrier della proteina T22-GFP-H6, precedentemente dimostrato di colpire selettivamente le cellule DLBCL che sovraesprimono il recettore CXCR4,15 ed è coniugato con l'MTA monometil auristatina E (MMAE), con l'obiettivo di uccidere selettivamente Celle DLBCL CXCR4+.Inoltre, questo nanoconiugato ha recentemente dimostrato efficacia nel trattamento di un modello murino diffuso di leucemia mieloide acuta aggressiva.16MMAE è stato testato in diversi studi clinici sempre coniugati con anticorpi monoclonali sotto forma di coniugati anticorpo-farmaco (ADC).17 Attualmente esistono due ADC-MMAE approvati dalla FDA, entrambi indicati per il trattamento di neoplasie ematologiche.18 Brentuximab vedotin ha come target il CD30, che è espresso nel linfoma anaplastico a grandi cellule e nelle cellule del linfoma di Hodgkin,19 mentre polatuzumab vedotin ha come target il marker CD79b ed è stato recentemente approvato per il trattamento dei pazienti con DLBCL R/R.20 Tuttavia, tutti gli ADC, inclusi questi due ADC -MMAE che hanno raggiunto il contesto clinico, condividono il problema dell'efficacia limitata perché meno dell'1% della dose totale di ADC somministrata raggiunge il tumore.21,22 Qui, abbiamo testato il nanoconiugato T22-AUR che mostra circa dodici ligandi CXCR4 per farmaco -nanoparticella caricata,16 che migliora l'assorbimento del tumore e l'uccisione selettiva delle cellule CXCR4+ DLBCL e porta a un potente blocco della disseminazione del linfoma riducendo la tossicità sistemica inorgani non infiltrati.Il nanocarrier T22-GFP-H6 è stato prodotto nel ceppo E. coli Origami B come precedentemente descritto in Int J Nanomedicine.2012;7:4533–44.Il monometil Auristain E (MC-MMAE) funzionalizzato con maleimmide è stato acquisito come sintesi personalizzata da Levena Biopharma (Levena Biopharma, San Diego, CA, USA).Il nanoconiugato T22-GFP-H6-MMAE (T22-AUR) è stato sintetizzato dal legame covalente di MC-MMAE a T22-GFP-H6 attraverso ammine di lisina proteica (generazione di legami alchilammina) in una reazione a vaso singolo.Per questo, T22-GFP-H6 è stato incubato in presenza di un eccesso molare 1:50 di MC-MMAE per 4 ore a temperatura ambiente in tampone carbonato di sodio (166 mM NaCO3H, 333 mM NaCl pH = 8).Il nanoconiugato T22-AUR è stato quindi purificato nuovamente mediante cromatografia di affinità IMAC al fine di rimuovere le molecole MC-MMAE libere non reagite.Infine, i nanoconiugati purificati sono stati dializzati contro il tampone di carbonato di sodio e filtrati attraverso un filtro a pori da 0,22 µm.L'efficienza di coniugazione è stata verificata mediante spettrometria di massa MALDI-TOF e concentrazione finale di nanoconiugato determinata mediante saggio Bradford.La distribuzione dimensionale del volume e il potenziale zeta del nanocarrier T22-GFP-H6 parentale e del nanoconiugato T22-AUR sono stati determinati rispettivamente mediante Dynamic Light Scattering (DLS) e Electrophoretic Light Scattering (ELS), in uno Zetasizer Nano ZS (strumenti Malvern) a 633 nm .La massa molare media della nanoparticella T22-GFP-H6 e del nanoconiugato T22-AUR è stata determinata mediante cromatografia ad esclusione dimensionale accoppiata a una dispersione della luce multi-angolo (SEC-MALS).Per questo, 200 µg di ciascun campione sono stati iniettati in una colonna Superdex 200 aumento 10/300 GL (GE Healthcare, Chicago, Illinois, USA) ed eseguiti in un tampone di carbonato di sodio integrato con zinco (166 mM NaCO3H, 333 mM NaCl, 0,1 mM ZnCl2 pH=8).L'eluente è stato monitorato da un rivelatore UV-Vis in linea, un rivelatore MALS Dawn Heleos e un rivelatore Optilab rEX RI (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, California, USA).Tutti i dati sono stati quindi analizzati dal software Astra 6.0.2.9 (Wyatt Technology Corporation) utilizzando un valore dn/dc di 0,185 (mL/g) e un valore del coefficiente di estinzione molare UV della proteina di 1,099 (mL/mg.cm).Le linee cellulari umane Toledo e U-2932 DLBCL sono state coltivate con terreno RPMI 1640 mentre la linea cellulare SUDHL-2 DLBCL umana è stata coltivata in terreno IMDM.Tutte le linee cellulari sono state integrate con 10% di siero bovino fetale (FBS), 1% di glutammina e 100 U/mL di penicillina-streptomicina (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) e sono state incubate a 37°C e 5% di CO2 in ambiente umidificato atmosfera.La linea cellulare Toledo è stata acquistata dalla American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia, USA) e la linea cellulare U-2932 dalla German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germania).Infine, SUDHL-2 è stato gentilmente fornito dal Dr. L. Pasqualucci (Columbia University, NY, USA) e il suo uso è stato approvato dal comitato etico della ricerca IIB-Sant Pau.La linea cellulare U-2932 è stata trasfettata con il gene della Luciferasi (pPK-CMV-F3, Promokine, TE Huissen, Paesi Bassi) mediante elettroporazione (Dispositivo Nucleofector TM 2b, Lonza, Basilea, Svizzera).Quindi, le cellule trasfettate sono state selezionate con 0,4 mg/mL di geneticina (Thermo Fisher Scientific) al fine di ottenere cloni stabili.Il sangue periferico fresco è stato ottenuto da donatori sani dopo aver acquisito il consenso informato e l'approvazione del Comitato Etico per la Ricerca Clinica dell'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau.I PBMC umani sono stati isolati mediante centrifugazione in gradiente Lymphoprep (Stem Cell Technologies Vancouver, BC, Canada) seguita dalla lisi dei globuli rossi (Thermo Fisher Scientific) secondo le istruzioni del produttore.I PBMC umani sono stati mantenuti in coltura per 48 ore nel mezzo di Dulbecco modificato (IMDM) di Iscove integrato con FBS inattivato al calore al 3%, L-glutammina 2 mM (Thermo Fisher Scientific), 20% BIT 9500 Serum Substitute (StemCell Technologies), 5 ng/ mL IL-3 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA), 5 × 10-5 M β-mercaptoetanolo (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), piruvato di sodio 1 mM e amminoacidi non essenziali 0,1 mM ( Thermo Fisher Scientific).La valutazione dell'internalizzazione di T22-AUR in diverse linee cellulari DLBCL è stata eseguita misurando i livelli di GFP del nanoconiugato e utilizzando il citometro a flusso FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).Le cellule sono state incubate con 10 nM T22-AUR per 1 ora.Quindi, le cellule sono state lavate con PBS e tripsinizzate per 15 minuti (1 mg/mL di tripsina, Thermo Fisher Scientific) al fine di rimuovere il legame non specifico dei nanoconiugati alla membrana cellulare.I test di competizione sono stati eseguiti preincubando le cellule per 1 ora con 100 nM dell'antagonista CXCR4 AMD3100 (Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, USA).I risultati sono stati analizzati con il software Cell Quest Pro (BD Biosciences) ed espressi come intensità media di fluorescenza (MFI).L'effetto citotossico in vitro di T22-AUR è stato valutato utilizzando il kit colorimetrico di proliferazione cellulare (XTT) dopo l'esposizione delle tre linee cellulari DLBCL (3,5·105 cellule/mL) o PBMC umane (10·105 cellule/mL) per tamponare (166 mM NaCO3H 333 mM NaCl, pH=8) o diverse concentrazioni di T22-AUR per 48 h in piastre da 96 pozzetti.Quindi, è stato aggiunto il reagente XTT (Roche Diagnostics, Basilea, Svizzera) e, dopo 4 ore di incubazione, la vitalità cellulare è stata quantificata misurando l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 492 nm utilizzando uno spettrofotometro FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech, Ortenberg, Germania).Inoltre, è stato valutato anche l'effetto citotossico di MMAE libero (Levena Biopharma) o veicolo DMSO (Sigma-Aldrich) nelle linee cellulari DLBCL seguendo la stessa procedura.L'IC50 di MMAE gratuito per tutte le linee cellulari DLBCL è stato calcolato utilizzando il programma GraphPad Prism 6.I test di vitalità della concorrenza sono stati eseguiti mediante un pretrattamento di 1 ora delle cellule U-2932 con AMD3100 seguito dall'aggiunta della nanoparticella T22-AUR (rapporto 10 AMD300 – 1 T22-AUR).I dati sono stati mostrati come percentuale di morte cellulare in relazione al suo controllo (tampone, DMSO o AMD3100).La determinazione della membrana CXCR4 è stata effettuata mediante citometria a flusso in PBMC umane e cellule DLBCL, dopo il lavaggio con PBS 0,5% BSA e incubazione con anticorpo monoclonale di topo PE-Cy5 anti-CXCR4 umano (BD Biosciences) o con isotipo IgG2a di topo PE-Cy5 (BD Biosciences ) come controllo negativo.I risultati sono stati analizzati utilizzando il citometro a flusso FACS Calibur con il software Cell Quest Pro ed espressi come rapporto di CXCR4 MFI diviso per isotipo MFI.Le cellule sono state trattate con tampone o 125 nM di T22-AUR per 24 ore e 48 ore.Quindi, 1,2·106 cellule sono state centrifugate e lavate con PBS.Successivamente, le cellule sono state fissate con etanolo freddo al 66% per 2 ore a 4°C, centrifugate e lavate con PBS.Infine, sono stati aggiunti ioduro di propidio (Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, USA) e RNAsi (Thermo Fisher Scientific) ad una concentrazione finale rispettivamente di 40 µg/mL e 20 µg/mL e le cellule sono state incubate a 37°C per 20 min.Le cellule sono state analizzate utilizzando il citometro a flusso FACS Calibur e i dati sono stati ottenuti utilizzando il software Cell Quest Pro (BD Biosciences).Le cellule Toledo, U-2932 e SUDHL-2 sono state seminate a 3,5·105 cellule/mL in flaconi di coltura cellulare da 75 cm2.Inoltre, le cellule U-2932 sono state trattate con tampone o 125 nM di T22-AUR per 24 ore e 48 ore.Quindi, blocchi cellulari inclusi in paraffina sono stati preparati dal pellet di sospensione cellulare centrifugata aggiungendo cinque gocce di plasma e trombina per intrappolare il materiale cellulare in un coagulo.Quindi, i coaguli cellulari sono stati collocati in una cassetta, fissati in paraformaldeide al 4% e inclusi in paraffina in un elaboratore di tessuti (Sakura, Tokyo, Giappone) per future valutazioni istologiche o immunoistochimiche (IHC).Le cellule U-2932 (3,5·105 cellule/mL) sono state incubate con tampone o T22-AUR 125 nM per 24 ore e 48 ore.Successivamente, le cellule sono state lavate con PBS, risospese con il 3,7% di paraformaldeide (Thermo Fisher Scientific) e fissate per 10 minuti a -20°C.Quindi, le cellule sono state risospese con 10 μL di PBS e lasciate asciugare all'aria su un vetrino.Infine, le cellule sono state colorate con un mezzo di montaggio DAPI (Thermo Fisher Scientific) e visualizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza (Olympus BX53, Olympus, Tokyo, Giappone).Le immagini rappresentative sono state scattate utilizzando una fotocamera digitale Olympus DP73 ed elaborate con il software cellSens Dimension 1.9 (Olympus) a 400x.Le cellule apoptotiche sono state visualizzate come condensazione della cromatina e/o formazione di corpi apoptotici, mentre le cellule della catastrofe mitotica (MC) come formazione di mitosi aberrante.Le cellule DLBCL sono state seminate a 3,5·105 cellule/mL e trattate con tampone o T22-AUR 125 nM per 24 o 48 ore.La percentuale di apoptosi (precoce/tardiva) per ciascuna condizione è stata valutata utilizzando il kit di rilevamento dell'apoptosi Annexin V-CF Blue/PI (Abcam, Cambridge, Regno Unito) e seguendo le istruzioni del produttore.I dati sono stati analizzati mediante citometria a flusso dell'analizzatore MACSQuant utilizzando il software MACS Quantify versione 2.3 (Miltenyi Biotec).Le cellule DLBCL sono state seminate a 3,5·105 cellule/mL e trattate con tampone o T22-AUR 125 nM per 24 ore e 48 ore.Quindi, le cellule sono state lavate con PBS e risospese in tampone di lisi (1 M Tris/acetato, 1 M saccarosio, 100 mM EDTA, 100 mM EGTA, 10% Triton-X-100, 100 mM Naorto, 100 mM Naβglicerolo, 0,5 M NaF , 100 mM Napiro, β-mercapto, 100 mM Benzamidina, 1,74 mg/mL PMSF e 2 mg/mL leupeptina).La sospensione cellulare è stata sonicata e lasciata riposare per 20 minuti in ghiaccio e centrifugata per 10 minuti a 18000 g a 4°C.La concentrazione proteica nel surnatante è stata determinata utilizzando il saggio proteico Bradford (BioRad, Hercules, California, USA), secondo le istruzioni del produttore.I lisati cellulari (50 μg) sono stati separati utilizzando il 12-15% di SDS-PAGE e trasferiti su una membrana assorbente di nitrocellulosa.Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% in TBST per 2 ore a temperatura ambiente e quindi incubate con anticorpi primari, 1:2000 PARP (556494, BD) O/N, 1:1000 caspasi-3 (610322, BD) O/ N, 1/1000 cleaved caspase-3 (9661, Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA) O/N, 1:10000 GAPDH (MAB374, Merck Millipore) per 1 ora o 1:1000 tubulina α/β (2148, Tecnologia di segnalazione cellulare) per 1 h.Le membrane sono state lavate con TBST e quindi incubate con l'appropriato anticorpo secondario (1:10000, Jackson Immune Research, West Grove, Pennsylvania, USA).La visualizzazione Western blot è stata eseguita utilizzando il substrato chemiluminescente SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific) e l'Universal Hood II Gel Doc Imaging System (BioRad).Topi NOD/SCID femmine di quattro settimane sono stati ottenuti dai Charles River Laboratories.I topi sono stati mantenuti in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (SPF) con cibo sterile e acqua ad libitum.Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato etico degli animali dell'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau (progetto numero 10108 del governo della Catalogna) ed eseguiti secondo la Direttiva dell'Unione Europea 2010–63-UE per il benessere degli animali da laboratorio.La biodistribuzione del nanoconiugato è stata valutata in un modello murino DLBCL sottocutaneo (SC).In primo luogo, 10 milioni di cellule DLBCL Toledo sono state iniettate in entrambi i fianchi dorsali dei topi NOD/SCID.La crescita del tumore è stata monitorata due volte a settimana con misurazioni del calibro bilaterale.I volumi medi del tumore sono stati calcolati utilizzando l'equazione (lunghezza·larghezza2)/2.Quando i tumori hanno raggiunto un volume di 600–800 mm3, i topi hanno ricevuto una singola dose endovenosa (IV) di 325 μg di T22-AUR (n=3/punto temporale) o 166 mM NaCO3H 333 mM NaCl pH=8 tampone (n=3) .L'intensità della fluorescenza (FLI) è stata misurata ex vivo in due punti temporali (5 ore e 24 ore) nei tumori sottocutanei e in tutti gli organi dopo aver accuratamente lavato ciascun organo con siero fisiologico.Il FLI emesso, espresso come efficienza radiante media, misura la quantità di T22-AUR accumulata, rilevata dall'emissione di fluorescenza del dominio GFP, in ciascun tessuto.FLI da topi sperimentali è stato calcolato sottraendo l'auto-fluorescenza FLI di topi di controllo.FLI è stato registrato nel sistema di imaging IVIS Spectrum 200 (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA).L'area sotto la curva (AUC) del FLI emesso durante il periodo 0–24 h è stata calcolata utilizzando il programma GraphPad Prism 6.Infine, i tumori sono stati raccolti, fissati e paraffinati per eseguire saggi di immunofluorescenza.I topi NOD/SCID sono stati iniettati per via endovenosa con 20 milioni di cellule U-2932 trasfettate con luciferasi in 200 μL di siero fisiologico.Tre giorni dopo l'iniezione cellulare, i topi sono stati divisi casualmente nel gruppo di controllo, somministrato con tampone (166 mM NaCO3H 333 mM NaCl, pH = 8) e il gruppo sperimentale somministrato con 100 μg di T22-AUR.La somministrazione di tampone o T22-AUR è stata eseguita tre volte alla settimana per dodici dosi.La disseminazione del linfoma è stata monitorata, una volta alla settimana, utilizzando l'imaging di bioluminescenza (BLI, fotoni di radianza totale) nello spettro IVIS (Perkin-Elmer).I topi sono stati anestetizzati con isoflurano al 3% in ossigeno e il BLI è stato catturato 5 minuti dopo l'iniezione intraperitoneale di lucciola D-luciferina (2,25 mg/topo, Perkin Elmer).Inoltre, nel corso dello studio è stato registrato il peso corporeo del topo.Tutti i topi sono stati sottoposti a eutanasia quando il primo topo ha presentato segni rilevanti di malattia come scarsa mobilità o significativa perdita di peso.In quel giorno, il BLI degli organi infiltrati da linfoma è stato analizzato ex vivo.Infine, tutti gli organi sono stati raccolti, fissati in formaldeide al 4% e inclusi in paraffina per ulteriori valutazioni istopatologiche o immunoistochimiche.Le sezioni di paraffina tumorale sono state utilizzate per l'immunorilevamento simultaneo della colorazione GFP, CXCR4 e DAPI in una microscopia confocale.I vetrini tumorali sono stati riscaldati 15 minuti a 60°C, decerati e reidratati.Il recupero dell'antigene è stato eseguito utilizzando tampone citrato pH = 9 con camera di decloaking.Per l'immunorilevamento, le sezioni sono state lavate 3 volte con TBS per 5 minuti e il tampone bloccante (TBS1x + 0,5% tritone + 3% siero di asino) è stato aggiunto 1 ora a temperatura ambiente.I vetrini sono stati incubati con gli anticorpi primari IgY 1:250 di pollo GFP (AVES, Davis, CA, USA) e gli anticorpi primari IgG 1:250 di coniglio CXCR4 (Abcam) durante la notte a 4°C e 2 ore a temperatura ambiente.Quindi, le sezioni sono state lavate e gli anticorpi secondari, un anticorpo IgY-Cy2 1:50 anti-pollo insieme a un anticorpo IgG-Cy5 1:200 anti-coniglio, sono stati aggiunti alle sezioni di tessuto per 2 ore a 37°C.Dopo altri tre lavaggi con TBS, le sezioni sono state colorate con DAPI 1:10000 per 10 minuti a temperatura ambiente e, infine, è stato aggiunto il mezzo di montaggio.Inoltre, per determinare se T22-AUR fosse colocalizzato con lisosomi, le cellule U-2932 vive sono state incubate per 5 ore con 1 µM di T22-AUR.Quindi, le cellule sono state centrifugate e risospese con 1 ml di terreno di coltura.LysotrackerTM DeepRed (Thermofisher) e Hoescht bisBenzimide H 33342 tricloridrato (Sigma-Aldrich) sono stati aggiunti rispettivamente a una concentrazione finale di 70 nM (37°C per 1 ora) e 1 μg/mL (37°C per 30 minuti).Tutte le immagini di immunofluorescenza sono state scattate con uno zoom 4,17 o 5,00 utilizzando l'obiettivo 63X/1,30 in un microscopio confocale TCS SPE (Leica, Wetzlar, Germania) utilizzando il software LAS AF (Leica).Tutte le sezioni d'organo dei campioni inclusi in paraffina sono state analizzate istopatologicamente (colorazione H&E) da due osservatori indipendenti per valutare l'effetto antineoplastica negli organi infiltrati con DLBCL o la possibile tossicità negli organi non infiltrati con DLBCL.Le immagini sono state scattate a 100x o 200x utilizzando una fotocamera digitale Olympus DP73 ed elaborate con il software cellSens Dimension 1.9 (Olympus).L'anticorpo anti-CXCR4 (1:300, Abcam) è stato utilizzato per la valutazione dell'espressione di CXCR4 nei blocchi cellulari di tre diverse linee cellulari DLBCL.In blocchi cellulari da cellule U-2932 trattate con T22-AUR.IHC anti-CD20, anti-CD79a, anti-Ki67 (Dako, Santa Clara, CA, USA) e anti-CXCR4 (1:300, Abcam) sono stati eseguiti in organi di topo inclusi in paraffina.Tutte le analisi IHC sono state eseguite in un DAKO Autostainer Link48 seguendo le istruzioni del produttore.L'area colorata delle cellule positive è stata quantificata utilizzando il software Olympus CellD Imaging 3.3 in 6 campi per blocchi cellulari e 12 campi per organi di topo.I dati sono stati mostrati come area colorata positiva dei campioni trattati con T22-AUR divisa per l'area colorata positiva dei campioni trattati con tampone.Le immagini sono state scattate a 100x, 200x o 400x.Inoltre, per la determinazione di CXCR4 in blocchi cellulari, le immagini sono state catturate con lo stesso identico tempo di esposizione e l'intensità di CXCR4 è stata misurata utilizzando il software Image J (1.8.0.172).Abbiamo utilizzato il plug-in Color Deconvolution con il vettore H DAB per dividere la colorazione marrone regolando la soglia su 30. Successivamente, è stato utilizzato il plug-in "Analizza particelle" per rilevare tutte le aree colorate e il valore medio di grigio è stato ottenuto combinando tutte le aree nere selezionate e utilizzando il ROI Manager.Il valore di intensità di ciascun vetrino analizzato è stato calcolato sottraendo 255 al valore medio di grigio ottenuto dall'analisi dell'immagine J.Tutti i risultati sono stati espressi come media ± errore standard (SE).Le differenze tra i gruppi sono state analizzate utilizzando il test T-Student o il test U di Mann-Whitney dopo il test di normalità (test di Shapiro Wilk).Le differenze sono state considerate statisticamente significative a p≤0,05.I calcoli statistici sono stati eseguiti utilizzando il software SPSS v21 (New York, NY, USA).Il nanoconiugato T22-AUR è stato generato dal legame covalente di molecole MMAE funzionalizzate maleimidocaproile (MC-MMAE) attraverso proteine ​​lisina-ammine esposte al solvente del nanocarrier T22-GFP-H6 in una reazione one-pot (Figura 1A).Gli spettri della spettrometria di massa MALDI-TOF hanno rivelato fino a 12 picchi con un incremento sequenziale di circa 911 Da sul peso molecolare della proteina T22-GFP-H6 (30,6 kDa) (Figura 1B), corrispondenti ciascuno all'incorporazione di un ulteriore MC-MMAE molecola (911 Da).La coniugazione T22-GFP-H6 non ha disturbato in modo significativo la struttura supramolecolare delle nanoparticelle, che ha mostrato un lieve aumento delle dimensioni (+5,5 nm) dopo la coniugazione (Figura 1C).Infine, l'analisi SEC-MALS ha mostrato un incremento medio della massa molare di 207 kDa nel nanoconiugato T22-AUR (564 kDa) rispetto alle nanoparticelle parentali T22-GFP-H6 (357 kDa).Questo fatto ha suggerito un'incorporazione media di circa 19 molecole MMAE per proteina (o circa 228 molecole MMAE per nanoparticella) considerando che ogni nanoparticella è composta da circa 12 monomeri della proteina T22-GFP-H6 (Figura 1D).Figura 1 Caratterizzazione del nanoconiugato T22-AUR.(A) Coniugazione di nanoparticelle T22-GFP-H6 con MMAE funzionalizzato maleimmide (MC-MMAE) attraverso ammine di lisina proteica per formare il nanoconiugato T22-AUR.Il numero di molecole MMAE coniugate (stelle viola) è solo indicativo.(B) Spettri di spettrometria di massa MALDI-TOF del nanoconiugato parentale T22-GFP-H6 e T22-AUR.Ogni picco superiore a 30,6 kDa in T22-AUR indica l'incorporazione covalente di una molecola MMAE aggiuntiva (+911Da).(C) Distribuzione delle dimensioni del volume (dimensioni) e potenziale zeta (zeta) della nanoparticella T22-GFP-H6 (rosso) e del nanoconiugato T22-AUR (viola) determinati dalla dispersione della luce.Pdi indica l'indice di polidispersione.I dati sono presentati come media ± errore standard.(D) Distribuzione media della massa molare della nanoparticella parentale T22-GFP-H6 (rossa) e del nanoconiugato T22-AUR (viola) determinata mediante cromatografia ad esclusione dimensionale accoppiata a una dispersione della luce multi angolo (SEC-MALS).Figura 1 Caratterizzazione del nanoconiugato T22-AUR.(A) Coniugazione di nanoparticelle T22-GFP-H6 con MMAE funzionalizzato maleimmide (MC-MMAE) attraverso ammine di lisina proteica per formare il nanoconiugato T22-AUR.Il numero di molecole MMAE coniugate (stelle viola) è solo indicativo.(B) Spettri di spettrometria di massa MALDI-TOF del nanoconiugato parentale T22-GFP-H6 e T22-AUR.Ogni picco superiore a 30,6 kDa in T22-AUR indica l'incorporazione covalente di una molecola MMAE aggiuntiva (+911Da).(C) Distribuzione delle dimensioni del volume (dimensioni) e potenziale zeta (zeta) della nanoparticella T22-GFP-H6 (rosso) e del nanoconiugato T22-AUR (viola) determinati dalla dispersione della luce.Pdi indica l'indice di polidispersione.I dati sono presentati come media ± errore standard.(D) Distribuzione media della massa molare della nanoparticella parentale T22-GFP-H6 (rossa) e del nanoconiugato T22-AUR (viola) determinata mediante cromatografia ad esclusione dimensionale accoppiata a una dispersione della luce multi angolo (SEC-MALS).Prima di valutare l'effetto terapeutico del T22-AUR, abbiamo prima determinato l'internalizzazione in vitro del nanoconiugato all'interno delle linee cellulari DLBCL attraverso il recettore CXCR4 espresso nella membrana cellulare.Le linee cellulari Toledo e U-2932 DLBCL avevano livelli elevati di recettore CXCR4 (cellule CXCR4+ DLBCL), raggiungendo valori medi di intensità fino a 227,68 ± 0,06 e 226,42 ± 0,05, rispettivamente, su un totale di 255. Al contrario, il SUDHL-2 la linea cellulare non esprimeva il recettore (Figura 2A e B).Quindi, l'internalizzazione di T22-AUR è stata misurata, dopo 1 ora di esposizione, quantificando l'emissione di fluorescenza del dominio GFP incorporato nel nanoconiugato.T22-AUR interiorizzato nelle cellule CXCR4+ DLBCL in quantità elevata, essendo l'MFI 27,88 ± 3,01 e 14,25 ± 1,64 rispettivamente nelle cellule Toledo e U-2932.Questa interiorizzazione era CXCR4-dipendente da quando le cellule CXCR4+ DLBCL sono state pre-incubate 1 ora con AMD3100, un antagonista del recettore CXCR4, l'ingresso del nanoconiugato è stato bloccato e l'MFI è diminuito significativamente, raggiungendo livelli fino a 5,92 ± 0,22 nelle cellule di Toledo e 4,02 ±0,09 nelle celle U-2932.Oltre a ciò, la linea cellulare negativa-CXCR4 SUDHL-2 ha mostrato bassi livelli di MFI (3,15±0,13) dopo 1 ora di esposizione a T22-AUR, che praticamente non differiva dalle cellule di controllo trattate con tampone (2,97±0,12) o cellule pre- incubato con AMD3100 prima dell'aggiunta di T22-AUR (2,97 ± 0,01) (Figura 2C).Figura 2 Valutazione dell'intensità dell'espressione di CXCR4 e dell'internalizzazione del nanoconiugato in diverse linee cellulari DLBCL.(A) CXCR4 IHC di Toledo, blocchi cellulari U-2932 e SUDHL-2.Le immagini sono state scattate a 400x (barre di scala = 50 μm).(B) Quantificazione dell'intensità di espressione media di CXCR4 contando sei campi colorati con IHC (400x) per blocchi cellulari Toledo, U-2932 e SUDHL-2.(C) Quantificazione dell'MFI mediante citometria a flusso nelle cellule Toledo, U-2932 e SUDHL-2 dopo la loro incubazione in tampone, 100 nM AMD3100 o 10 nM T22-AUR per 1 ora o dopo il pretrattamento per 1 ora con 100 nM AMD3100 seguito da l'aggiunta di 10 nM di nanoconiugato per 1 h (AMD3100 + T22-AUR).Questo esperimento è stato eseguito in triplicati biologici.Tutti i dati sono mostrati come media ± errore standard.**p≤0,01.Abbreviazioni: IHC, immunoistochimica, MFI, intensità media di fluorescenza.Figura 2 Valutazione dell'intensità dell'espressione di CXCR4 e dell'internalizzazione del nanoconiugato in diverse linee cellulari DLBCL.(A) CXCR4 IHC di Toledo, blocchi cellulari U-2932 e SUDHL-2.Le immagini sono state scattate a 400x (barre di scala = 50 μm).(B) Quantificazione dell'intensità di espressione media di CXCR4 contando sei campi colorati con IHC (400x) per blocchi cellulari Toledo, U-2932 e SUDHL-2.Tutti i diritti riservati.